X-射线诱导大肠癌细胞PCD与p53转录表达改变

　　材料和方法

　　一、细胞、主要试剂和仪器　HT-29、Lovo细胞为本实验室自存；X-射线直线加速器(Varian 2100C型)由本院放疗中心提供；MAb1801购自Santa Cruz公司；ABC试剂盒为Vector公司产品；p53质粒(pUC18-p53)为本实验室自存；光敏生物素标记试剂盒和标记灯由军事医学科学院提供；透射电镜(JEM-1200-EX)由本院中心实验室提供。

　　二、实验步骤和方法

　　1.常规培养的HT-29、Lovo细胞经胰酶消化后，用PBS洗涤细胞，将细胞转移至无菌聚丙烯离心管中，分别给予5 Gy，10 Gy，15 Gy， 20 Gy，25 Gy剂量进行照射。对照组也以PBS洗涤细胞后，同时置于聚丙烯管中，但不经射线照射。经比色测定确定10 Gy为最适研究剂量。

　　2.按上述方法照射细胞后，取10 Gy照射组将细胞悬液离心，去除PBS，以1640完全培养液重悬细胞，将细胞按105/ml分别接种于3个50 cm2培养瓶内培养。于48 h常规用胰酶消化，第1瓶用于制作细胞涂片，进行p53MAb1801的IHC和p53 mRNA的ISH分析［3］。分别在×100和×800光镜下取标本四角及中间共5个视野，计数阳性和阴性细胞数，统计采用χ2检验。第2瓶用于制作超薄切片标本，透射电镜观察(×6000)。第3瓶细胞培养至HT-29细胞大部分脱落，Lovo细胞由梭形变为圆形，收集细胞提取DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察。阴性对照：未经照射的细胞，经培养48 h后收集细胞提取DNA进行电泳。阳性对照：取2只昆明小鼠(4周龄，本院动物中心提供)，无菌取下胸腺制成细胞悬液，1640培养液中加入终浓度为10-5mol/L的地塞米松培养6 h后收集细胞提取DNA进行电泳观察。

　　结　　果

　　一、X-射线诱导HT-29、Lovo细胞PCD　HT-29、Lovo两种细胞经X-射线照射后48 h，电镜下两种细胞出现PCD早期改变：细胞染色质浓积于细胞核内某些部位，如核膜周围，形成前期凋亡小体。并可见少数形成核碎片，为质膜系统所包裹。有些细胞核出现空泡现象，胞浆肿胀，质膜系统增生肿胀，线粒体等细胞器增生(见图1)。X-射线处理48 h后，两种细胞皆出现不同程度的梯状电泳带，与阳性对照稍显弥散，不如阳性对照典型。而阴性对照则无此现象，电泳时仅发现高分子基因组DNA。