出血性败血症诊断技术

中健网 >> 疾病库 >> 血液病 >> 败血症 2006年08月18日 中健网·血液病 佚名

  出血败血症是黄牛和水牛的一种急性、高度致死性的败血性疾病。由多杀性巴氏杆菌的某些血清型 ,特别是血清型 6:B (亚洲株 )和 6:E (非洲株 )引起。埃及和苏丹等几个国家存在这两个血清型。出血性败血症是一种原发性巴氏杆菌病 ,只能用病原菌的纯培养物才能在易感动物复制出这种病。

  临床诊断可根据特征的症状、眼观病变、群的历史、发病和死亡模式。

  一、病原鉴定 :

  出血性败血症的血病实为病末期。因此 ,从临死前病畜采取的血液样品不常含多杀性巴氏杆菌 ,而且也不会在病畜的鼻分泌物中存在。

  如在病畜死前几小时内 ,从心脏采取血样样品或拭子 ,则最为满意。如果病畜已死亡较长时间 ,则应取游离组织的长骨 ;如果没有作死后检查的设施 ,则可从颈脉采取 (切开或吸取 )血液。放在标准运输培养基中的血样应包装严密 ,以防泄露 ,并置冰上后迅速运送。感染动物的血液涂片 ,用革兰氏或亚甲基兰染色。该菌为革兰氏阴性 ,两极染色的短杆菌。只根据直接显微镜检查 ,尚不能作出确诊。

  适合巴氏杆菌生长的一种培养基 ,是含 5%血液的酪蛋白──蔗糖──酵母琼酯。它的组成为 :水解酪蛋白 3克 ,蔗糖 3克 ,酵母浸膏 5克 ,氯化钠 5克 ,无水硫酸氢二钾 3克 ,加蒸馏水到 1升。将 P H值调为 7. 3- 7. 4后 ,高压灭菌 15分钟 ,最后加入无菌琼脂,使其终末浓度为 1. 5%。待冷却到 45- 50℃时 ,加 5%犊牛血液 (无多杀性巴氏杆菌抗体 )。

  血液样品或用 2- 3毫升无菌正常生理盐水洗下的拭子物质直接进行培养。如果是长骨样品 ,则表面先用酒精擦 ,再经火焰灭菌后切开。无菌抽取骨髓样品 ,作培养。只要材料新鲜 ,无污染或者死后没有受到其他过分生长的任何巴氏杆菌的侵袭 ,则直接培养通常是满意的。

  作生物学检查时 ,是将少量血液拭子洗涤物或用生理盐水悬浮的部分骨髓样品 ,皮下或肌肉内接种 (0. 2毫升 )小鼠 ,鼠通常可抵外来微生物。接种后 ,小鼠一般在 24- 36小时死亡 ,并在鼠的血液涂片中可见到纯的多杀牲巴氏杆菌。用鼠的血液培养物一般能获得纯培养。甚至原始样品来于死亡已久的病畜也如此。细菌可通过形态学与培养特性、生化反应及血清学试验来鉴别。

  新鲜分离的多杀性巴氏杆菌在血液琼脂上于 37℃培养 24小时后 ,能形成光滑的 ,有灰色光泽的 ,半透明的菌落 ,直径约 1毫米。在琼脂上 ,菌落较大。陈旧培养物 ,特别是在那些无血培养基上的生长物 ,能形成小的菌落。在麦康凯琼脂上不生长。革兰氏染色的血液或组织涂片中 ,出现革兰氏阳性、短的、卵圆形、两极着色的球状菌。有时还有一定程度的多形性 ,特别是陈旧的培养物 ,呈现不同长度杆状形。用亚甲兰染色时 ,两极染色更明显。

  出血性败血症杆菌能产生氧化酶、过氧化氢酶及吲垛 ,能还原硝酸盐。不产生硫化氢或尿素酶 ,不能利用柠檬酸盐或液化明胶。可发酵葡萄糖和蔗糖 ,产酸。大多数菌株也发酵山梨糖醇。有些菌株发酵阿拉伯糖 ,木糖及麦芽糖 ,而对水扬甙及乳糖几乎不发酵。非出血性败血症的多杀性巴氏杆菌血清型的鉴定可用几种血清学方法进行 ,包括快速玻片凝集试验 ,作荚膜分型间接血凝试验。用盐酸处理的菌体凝集试验作菌体抗原分型 ,以及琼脂凝胶扩散试验。

  大多数血清学试验中所用的抗血清是用兔抗参考菌株制备的。将酪蛋白──蔗糖──酵母肉汤的 6- 8小时培养物 ,接种到血液琼脂培养基上 ,培养过夜 (18- 20小时 )后 ,用含 0. 3%福尔马林的生理盐水将生长物洗下。将菌体悬液的浊度调到布朗氏比浊管的第7管。每隔 3- 4天 ,兔静脉注射一次菌液 ,量分别为 0. 2、 0. 5、 1. 0、 1. 5及2. 0毫升 (最后 )。末次注射后一周 ,取 0. 5毫升相同的活菌悬液 ,给兔皮下或肌肉内接种 , 10天后放血。血清保存于 4℃ ,但少量常用的血清加 1: 10000的硫柳汞后 ,在 4℃保存。

  1、快速玻片凝集试验

  将一个菌落用一滴生理盐水在玻片上混合 ,加一滴抗血清 ,并慢慢加热玻片。在 30秒内可出现粗的紫状凝集。陈旧的培养物则出现细的颗粒状凝集 ,且时间较长。

  2、间接血凝试验 (荚膜定型 )

  该方法最初用人的“ O”型红细胞 ,现在常用绵羊红细胞。抗原制备如下 :将参考菌株6: B或 6: E的 6- 8小时肉汤培养物 ,接种到酪蛋白──蔗糖──酵母血琼脂板上 , 37℃培养过夜。用含 0. 3%福尔马林的 3毫升生理盐水将生长物洗下。然后 ,在 56℃加热 30分钟 ,在 4℃以 3000g离心 15分钟 ,上清液保存在 - 20℃。如果不能冷冻离心 ,则以 1500g离心 30分钟 ,上清液用作抗原提取物。

  无菌采集绵羊血液 ,加入抗凝剂 ,以 500g离心 10分钟。沉淀的红细胞用无菌生理盐水洗 3次。抗血清 (3体积 )中加入沉淀的红细胞 (1体积 ),在 37℃吸收 2小时 ,期间摇动几次。加提取的抗原 (15体积 )到红细胞 (1体积 )中 ,在 37℃振荡致敏 1小时,离心收集致敏的红细胞。再用无菌生理盐水洗 3次 ,最后用生理盐水配成 1%悬液。试验可在试管或血凝板中进行 ,每次做相同的两份。第一孔加 8滴生理盐水 , 2滴灭活的吸附过的抗血清 ,所有其他的每扎加 5滴生理盐水。血清 1滴稀释混合后取 5滴加到倒数第二孔 ,最后一孔为无血清对照孔。第一排加同体积 (5滴 )1%的致敏红细胞悬液 ,第二排加 1%的未致敏红细胞悬液作为对照。将血凝板摇动后 ,置室温作用 2小时。红细胞的粗糙凝集为阳性结果 ;出现小钮扣红细胞沉积为阴性反应。

  3、菌体抗原定型

  将 6- 8小时的待检培养物接种到酪蛋白──蔗糖──酵母血琼脂培养基上 ,培养过夜。每块板用 2~ 3毫升 0. 3%福尔马林生理盐水将生长物洗下混合后 ,在 4℃以 3000g离心 15分钟或以 1200- 1500g在室温离心 30- 45分钟 ,沉积的细菌用 25毫升盐酸生理盐水重悬到布朗氏比浊管第 6管的浊度 ,再培养过夜。悬液再离心 ,上清液弃去,沉淀的细菌分别用 P H为 5. 0、 6. 0及 7. 0的磷酸缓冲盐水连续洗涤。

  最后 ,用 P H 7. 0的磷酸缓冲盐水将沉淀的菌体悬浮到相当于布朗氏比浊管第 6管的浊度。如果悬液发生自凝 ,则弃去。

  抗血清是用抗参考菌株 6: B , 6: E及 11: B全菌体悬液制得的。凝集试验是在玻片上用待检抗原与 3个型的血清进行。出现细的颗粒状凝集时 ,即为特异性的菌体凝集。与标准菌体的试验将有助于结果的读取与解释。

  当出现非特异性的部分凝集时 ,则用 10倍稀释的血清与待检抗原和参考抗原分别作试管凝集 ,将有助于鉴定菌体抗原。

  4、免疫扩散试验

  免疫扩散试验依据所用的抗原与抗体 ,作“荚膜”或菌体抗原的定型。一般用双扩散试验。在固体琼脂上 ,打一个中央孔和六个周边孔。

  荚膜定型 :凝胶培养基是用含 1: 10000硫柳汞的 0. 2M磷酸盐缓冲液 ,将优级琼脂或同质量产品配成 1%的浓度后制成。用于荚膜定型的抗原及抗血清与间接血凝法所用的相同。参考抗血清放在中央孔 ,待检抗原与参考的同源性抗原加到周边孔内。菌体定型 :凝胶培养基是用 8. 5%氯化钠溶液 ,将特殊的优级琼脂或者同质量的产品,配成 0. 9 %的浓度后制成。 1毫升 8. 5%氯化钠溶液 (含 0. 3%福尔马林 )将每块板上的细菌生长物洗下。并在 100℃加热 1小时 ,离心沉淀菌体 ,上清液即为抗原。抗血清用鸡制备 , 12到 16周龄的公鸡颈中部皮下 ,接种 1毫升死菌苗。 3星期后采血 ,并分离血清。

  5、血清型命名

  一般采用 2种定型系统一种是荚膜定型 ,采用血凝试验或免疫扩散试验。另一种是菌体定型。一般同意 ,将荚膜──菌体结合起对血清型命名。

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